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堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase ，AKP/ALP） 活性測定試劑盒

商品貨號：QS2002
英文名稱：Tissue and Blood Alkaline Phosphatase（AKP/ALP） Assay Kit
別名：組織及血液堿性磷酸酶試劑盒 AKP/ALP Kit 組織及血液堿性磷酸酶（AKP/ALP）試劑盒
檢測方法：常量法

• 產(chǎn)品詳細介紹
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測定意義：                           

AKP/ALP是一種含鋅的糖蛋白酶，在堿性環(huán)境中可水解各種天然及人工合成的磷脂單酯化合物。AKP/ALP廣泛分布于人體各臟器中，以肝臟為主。

測定原理：

在堿性環(huán)境中，AKP/ALP催化磷酸苯二鈉生成游離酚；酚與4-氨基安替比林和六氰合鐵酸鉀反應(yīng)紅色亞醌衍生物，在510nm有特征光吸收；通過測定510 nm吸光度增加速率，來計算AKP活性。

• 產(chǎn)品說明書

貨號: QS2002             規(guī)格：50管/24樣

  堿性磷酸酶（alkaline phosphatase ，AKP/ALP） 活性測定試劑盒說明書

          可見分光光度法

注意：正式測定之前選擇 2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

AKP/ALP 是一種含鋅的糖蛋白酶，在堿性環(huán)境中可水解各種天然及人工合成的磷脂單酯化 合物。AKP/ALP 廣泛分布于人體各臟器中，以肝臟為主。

測定原理：

在堿性環(huán)境中，AKP/ALP 催化磷酸苯二鈉生成游離酚；酚與 4-氨基安替比林和六氰合鐵酸鉀反應(yīng)紅色亞醌衍生物，在 510nm 有特征光吸收；通過測定 510 nm 吸光度增加速率，來計算 AKP 活性。

自備實驗用品及儀器：

可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體×1 瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體×1 瓶，4℃避光保存。

試劑四：液體×1 瓶，4℃避光保存，未變成藍綠色之前均可使用。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1 支（EP 管中），2 μ mol/mL 酚標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存。

粗酶液提取：

1. 組織：

按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加 入 1mL 試劑一）進行冰浴勻漿，4℃、8000g 離心 10min，取上清液待測。

2. 細菌或細胞：

按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：試劑一體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建 議 500 萬細胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒， 總時間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測。

3. 血液可直接測定，或者適當(dāng)稀釋后測定。

測定步驟：

1. 分光光度計預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長到 510 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑三置于 37℃水浴中預(yù)熱 30 min。

3. 空白管：取 EP 管，加入 20μ L 蒸餾水，200μ L 試劑二，200μ L 試劑三，混勻后置于 37℃ 水浴中保溫 15min；加入試劑四 600μ L，混勻后于 510 nm 測定吸光度，記為 A 空白管。

4. 標(biāo)準(zhǔn)管：取 EP 管，加入 20μ L 標(biāo)準(zhǔn)品，200μ L 試劑二，200μ L 試劑三，混勻后置于 37℃ 水浴中保溫 15min；加入試劑四 600μ L，混勻后于 510 nm 測定吸光度，記為 A 標(biāo)準(zhǔn)管。

5.對照管：取 EP 管，加入 20μ L 上清液，200μ L 蒸餾水，200μ L 試劑三，混勻后置于 37℃ 水浴中保溫 15min；加入試劑四 600μ L，混勻后于 510 nm 測定吸光度，記為 A 測定管。

6. 測定管：取 EP 管，加入 20μ L 上清液，200μ L 試劑二，200μ L 試劑三，混勻后置于 37℃ 水浴中保溫 15min；加入試劑四 600μ L，混勻后于 510 nm 測定吸光度，記為 A 測定管。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測定一次。每個測定管設(shè)一個對照管。

AKP/ALP 活性計算：

1. 血液中 AKP/ALP 活力計算

活性單位定義：37℃中每毫升血液每分鐘催化產(chǎn)生 1μ mol 酚定義為 1 個酶活單位。

AKP/ALP 活力(μ mol/min /mL)= [C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)×V 反總] ÷V 樣÷T=6.8×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)

2. 組織、細菌或細胞中 AKP/ALP 活性計算

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義：37℃中每毫克蛋白每分鐘催化產(chǎn)生 1 μ mol 酚定義為 1 個酶活單位。

AKP/ALP(μ mol/min/mg prot)=[C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)×V 反 總]÷(Cpr×V 樣)÷T=6.8×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：37℃中每克組織每分鐘催化產(chǎn)生 1 μ mol 酚定義為 1 個酶活單位。

AKP/ALP(μ mol/min/g 鮮重)=[C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)×V 反 總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=6.8×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷W

（3）按照細菌或細胞數(shù)量計算

活性單位定義：37℃中每 10⁴個細菌或細胞每分鐘催化產(chǎn)生 1 μ mol 酚定義為 1 個酶活單位。 AKP/ALP (μ mol/min/10⁴ cell)= [C 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)×V 反總]÷(細胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T= 6.8×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷ 細胞數(shù)量

C標(biāo)準(zhǔn)品：2μ mol/mL；V 反總：反應(yīng)體系總體積（mL），1020μ L=1.02 mL； V 樣：加入反應(yīng) 體系中上清液體積（mL），0.020mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間（min），15 min。

注意事項：

1.試劑二、試劑三和試劑四均需避光保存。

2.試劑四變藍綠色后不能再使用。

3.加入試劑四后必須立即混勻，否則顯色不*。

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